|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Role konservovaného tyrozinu acylované domény v inzerci a penetraci RTX toxinů
Lepesheva, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
RTX toxiny tvořící póry jsou klíčovými faktory virulence mnoha gramnegativních patogenů. Tyto proteiny sdílejí několik společných strukturních a funkčních vlastností: (i) přítomnost opakujících se sekvencí bohatých na glycin a aspartát, důležitých pro vazbu iontů vápníku, (ii) transport z cytozolu bakterií sekrečním systémem typu I (T1SS), (iii) modifikace mastnou kyselinou na specifických lyzinech v acylované doméně vlastní acyltransferázou a (iv) přítomnost amfipatické oblasti, která je zodpovědná za tvorbu pórů selektivních pro kationty. Bylo ukázáno, že aromatický postranní řetězec konzervovaného tyrozinového zbytku 940 (Y940) v acylovaném segmentu adenylátcyklázového toxinu (CyaA, ACT nebo AC-Hly) bakterie Bordetella pertussis hraje klíčovou roli v interakci toxinu s cílovou buněčnou membránou. Cílem této práce bylo ukázat, zda odpovídající konzervovaný zbytek Y940 u CyaA z bakterie Bordetella bronchiseptica, Y642 u HlyA z Escherichia coli, Y643 u ApxIA z Actinobacillus pleuropneumoniae a Y639 u RtxA z Kingella kingae, hraje stejnou kritickou roli v membránové inzerci a tvorbě pórů. Hemolytické a cytotoxické aktivity těchto homologních RTX toxinů byly plně zrušeny pouze po nahrazení konzervovaných tyrozinů prolinovými zbytky. Substituce tyrozinu za alanin mírně snížila cytolytickou kapacitu...
|
|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
|
Role segmentu 400-500 v biologické aktivitě adenylát cyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis
Suková, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát cyklázový toxin-hemolyzin (CyaA) je RTX protein, který hraje zásadní roli ve virulenci bakterie Bordetella pertussis, způsobující onemocnění černý kašel. CyaA dopravuje do cytosolu CD11b+ fagocytů svou enzymatickou adenylát cyklázovou doménu a katalyzuje přeměnu ATP na cAMP, které následně zablokuje baktericidní funkce fagocytů. Současně toxin vytváří v membráně cílových buněk póry, způsobující únik draselných iontů z buňky. Cílem této diplomové práce bylo analyzovat mechanizmus interakce domény spojující invazivní adenylát cyklázovou (AC) doménu a tzv. RTX hemolyzin s biologickou membránou. Z našich výsledků vyplývá, že tato doména interaguje s cílovou membránou a hraje zásadní roli v tvorbě malých pórů selektivních pro kationty. Získané výsledky budou zásadní pro pochopení interakce bakteriálních toxinů s cílovou membránou a naleznou reálné použití při vývoji terapeutických vakcín odvozených od CyaA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, adenylát cyklázový toxin, translokace přes membránu, pórotvorná aktivita, černé lidipové membrány, liposomy
|
|
|
Vliv vápenatých iontů a cholesterolu na kanálotvornou aktivitu Adenylát-cyklázového toxinu
Doktorová, Eliška ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Horák, Martin (oponent)
1 Abstrakt Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis, která způsobuje onemocnění černý kašel. CyaA působí na hostitelskou buňku dvěma možnými, na sobě nezávislými, způsoby. Jedním je tvorba malých kationt-selektivních kanálů, která může vést až ke koloidně osmotické lyzi cílových buněk. Druhým je rozvrat buněčné signalizace po translokaci adenylát- cyklázové (AC) domény do cytozolu hostitelské buňky, což vede k přeměně ATP na cyklické AMP. V nedávné době bylo dokázáno, že cholesterol má vliv na průběh endocytózy CyaA. CyaA translokuje svou AC doménu až po přesunu celé molekuly CyaA do místa bohatého na cholesterol, tzv. lipidového raftu (Bumba et al. 2010). V této práci jsem se zabývala vlivem cholesterolu na kanálotvornou aktivitu a iontovou selektivitu CyaA kanálů. Pro měření byla užívána umělá membrána obohacená o cholesterol. Kanály CyaA jsou závislé na elektrickém napětí. Pro zabudování molekuly CyaA do membrány je potřeba kladného elektrického napětí na straně toxinu. Snažila jsem se zjistit, zda má hodnota vloženého elektrického napětí na membránu vliv na dobu otevření kanálu a dobu, za kterou se molekula CyaA zabuduje do membrány. Pro toxickou aktivitu CyaA jsou zásadní vápenaté ionty. Jsou potřeba pro hemolytickou aktivitu i pro přenos...
|
host ::
RSS.